铁蛋白重链亚基纳米载药系统的构建及其逆转乳腺癌细胞多药耐药性的研究

作者: 专业:生物化学与分子生物学 导师:曹旭妮 年度:2015 学位:硕士  院校: 华东理工大学

关键词
铁蛋白重链亚基纳米载药系统 靶向 耐药性

        癌症是目前危害人类健康的最严重的一类疾病。在发达国家癌症的死亡率仅次于心血管疾病居第二位,在我国,癌症的死亡率也逐年快速增长中。目前癌症的主要疗法是手术配合化疗,然而化疗药物的毒性副作用和癌细胞的耐药性是癌症治疗中的主要障碍。本研究的主要目的是,构建具有靶向性、高度生物安全性的人表皮生长因子-铁蛋白重链亚基纳米载药系统(DOX/EGF-5Cys-FTH1),以癌细胞膜表面过表达的表皮生长因子受体(EGFR)为靶点,考察了该给药系统逆转人乳腺癌细胞株MCF-7/ADR的耐药性,并对其中的机制进行了详细研究。在本研究中,首先构建靶向性铁蛋白纳米载药系统。铁蛋白是一种广泛存在于人、动植物体内的天然蛋白,因此具有较高的生物安全性;表皮生长因子受体在多种肿瘤细胞中高表达,它已被用来作为用于癌症治疗的靶向目标。因此,我们用基因工程的方法将人表皮生长因子EGF融合于铁蛋白重链亚基FTH1,构建EGF-FTH1纳米粒子。然而,FTH1的内部空间太小装载阿霉素载药量低。为了解决这个问题,我们通过基因突变的方法使得载体巯基化以获得更多的连接位点从而增加载药量。结果发现,72分子阿霉素分子中可以被加载到一个DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米粒子上,且在pH5.0的酸性环境中药物被释放。此外,所得到的DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统具有体积小(约12微米)和粒径分布窄的特征。细胞内化实验结果表明DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米粒子可以进入细胞内,并且MTT数据说明该纳米载药系统与游离阿霉素药物相比对耐药株癌细胞具有更强的杀伤力。同时,我们还对其逆转耐药性的机制做了详细的研究,整个过程表明结果如下:1)通过受体介导的内吞作用DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统能携带更多的DOX进入细胞,2)内化入细胞后在溶酶体中快速释放药物分子,3)使得更多的药物进入细胞核,改变细胞的周期,引起细胞死亡。以上研究结果表明铁蛋白纳米粒子作为一类新型的纳米载体系统,在癌症靶向方面有巨大发展前景。也为其在临床的进一步应用提供了一定的理论基础。
        

铁蛋白重链亚基纳米载药系统的构建及其逆转乳腺癌细胞多药耐药性的研究

摘要5-6
Abstract6-7
第1章 前言12-26
    1.1 癌症治疗现状12-13
    1.2 纳米技术在癌症中的研究情况13-14
        1.2.1 目前用于癌症治疗的纳米粒子种类13
        1.2.2 靶向治疗的研究13-14
            1.2.2.1 被动靶向13-14
            1.2.2.2 主动靶向14
    1.3 相关靶向方式的研究14-18
        1.3.1 新生血管性靶向14
        1.3.2 不受控制的细胞增殖靶向14-16
            1.3.2.1 人表皮受体15
            1.3.2.2 转铁蛋白受体15
            1.3.2.3 叶酸受体15-16
        1.3.3 肿瘤细胞靶向16-18
            1.3.3.1 靶向乳腺癌16-17
            1.3.3.2 结肠直肠癌靶向17
            1.3.3.3 肺癌靶向17-18
            1.3.3.4 前列腺癌靶向18
    1.4 多药耐药性的研究18-24
        1.4.1 脂质体19
        1.4.2 聚合物胶束19-20
        1.4.3 多肽和蛋白20-21
        1.4.4 磁性纳米粒子21-22
        1.4.5 金纳米粒子22-23
        1.4.6 硅纳米粒子23
        1.4.7 碳纳米管23
        1.4.8 固体脂质纳米粒子23-24
    1.5 本论文的研究意义24-26
第2章 铁蛋白重链亚基纳米载药系统的构建及其特性研究26-56
    摘要26
    2.1 前言26-27
    2.2 实验材料27-29
        2.2.1 菌株和质粒27
        2.2.2 药品和试剂27-28
        2.2.3 实验仪器28-29
    2.3 实验方法29-45
        2.3.1 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1质粒的构建29-32
            2.3.1.1 引物设计和模板验证29-30
            2.3.1.2 质粒的构建30-32
        2.3.2 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1纳米粒子的制备32-37
        2.3.3 非靶向EGF-5Cys-FTH1-m质粒的构建37-39
            2.3.3.1 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1-m引物设计37
            2.3.3.2 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1-m质粒的构建37-39
        2.3.4 pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1-m纳米粒子的制备39-41
            2.3.4.1 EGF-5Cys-FTH1-m蛋白在E.coli BL21中的表达39-41
        2.3.5 目标蛋白的表征41
            2.3.5.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(NATIVE-PAGE)41
            2.3.5.2 透射电子显微镜41
        2.3.6 EGF-5cys-FTH1和EGF-5cys-FTH1-m蛋白的荧光标定41-42
            2.3.6.1 荧光标定后纯化及偶联比测定42
        2.3.7 纳米粒子与细胞结合研究42-43
            2.3.7.1 细胞培养42
            2.3.7.2 流式细胞仪检测目标粒子与细胞结合情况42-43
            2.3.7.3 荧光显微镜观察目标粒子与细胞结合情况43
        2.3.8 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米给药系统的构建43-45
            2.3.8.1 交联剂与阿霉素的连接44
            2.3.8.2 EMCH-DOX与EGF-5Cys-FTH1蛋白的连接44-45
        2.3.9 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统中药物的体外释放特性的研究45
    2.4 实验结果45-54
        2.4.1 EGF-5Cys-FTH1和EGF-5Cys-FTH1-m质粒的构建45-47
            2.4.1.1 反向PCR产物验证45-46
            2.4.1.2 质粒pET-28a(+)/EGF-5Cys-FTH1菌落PCR产物的验证46
            2.4.1.3 酶切验证46-47
            2.4.1.4 目标质粒的测序结果47
        2.4.2 纳米粒子的制备47-49
        2.4.3 EGF-5Cys-FTH1纳米粒子的表征49-50
            2.4.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳49
            2.4.3.2 透射电子显微镜(TEM)49-50
        2.4.4 纳米粒子在细胞水平上的靶向研究50-51
            2.4.4.1 流式细胞仪法检测纳米粒子与细胞的结合50-51
            2.4.4.2 荧光显微镜观察纳米粒子与细胞结合情况51
        2.4.5 DOX/EGF-5Cys-FTH1载药系统的构建与表征51-53
            2.4.5.1 EMCH-DOX与EGF-5Cys-FTH1连接52
            2.4.5.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米粒子的稳定性52-53
            2.4.5.3 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米粒子表征53
        2.4.6 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统中药物在PBS缓冲溶液中的释放53-54
    2.5 讨论54-55
    2.6 小结55-56
第3章 铁蛋白重链亚基纳米载药系统逆转乳腺癌细胞多药耐药性的研究56-73
    摘要56
    3.1 前言56-57
    3.2 实验材料57-59
        3.2.1 细胞株57
        3.2.2 药品和试剂57-58
        3.2.3 实验仪器58-59
    3.3 实验方法59-64
        3.3.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统在细胞水平的内化59-61
            3.3.1.1 癌细胞的复苏和培养59
            3.3.1.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米给药系统的靶向实验59-60
            3.3.1.3 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统细胞水平内化60-61
            3.3.1.4 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统细胞内定位61
        3.3.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统的药效研究61-64
            3.3.2.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统细胞内化后细胞形态研究61
            3.3.2.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统内化后药效情况61-62
            3.3.2.3 MTT法细胞存活率研究62-63
            3.3.2.4 细胞周期研究63-64
            3.3.2.5 细胞凋亡研究64
    3.4 实验结果64-71
        3.4.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米给药系统的药效特性研究64-66
        3.4.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统逆转MCF-7/ADR细胞耐药性机制研究66-71
            3.4.2.1 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统靶向及内化研究66-67
            3.4.2.2 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统逆转MCF-7/ARD耐药性的研究67-68
            3.4.2.3 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统细胞内释放机制68-69
            3.4.2.4 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统释放DOX入核情况研究69-70
            3.4.2.5 DOX/EGF-5Cys-FTH1纳米载药系统对细胞周期和细胞凋亡的影响研究70-71
    3.5 讨论71-72
    3.6 小结72-73
参考文献73-80
致谢80


本文地址:

上一篇:基于疗效的川产道地药材附子品质评价方法研究
下一篇:公立医院绩效管理体系研究

分享到: 分享铁蛋白重链亚基纳米载药系统的构建及其逆转乳腺癌细胞多药耐药性的研究到腾讯微博           收藏
发表网-铁蛋白重链亚基纳米载药系统的构建及其逆转乳腺癌细胞多药耐药性的研究-在线咨询