我国部分地区柑橘衰退病毒基因型研究

Study on Genotypes of Citrus Tristeza Virus from Some Citrus Cultivation Regions in China

作者: 专业:植物病理学 导师:洪霓 年度:2010 学位:硕士  院校: 北方工业大学

Keywords

        柑橘衰退病为柑橘上发生危害最严重的病毒病,在世界主要柑橘产区均有发生。引起该病害的病原柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),属于线形病毒科(Closteroviridae),长线形病毒属(Closterovirus)。根据其在寄主植物上所引起的不同症状,可分为速衰株系、茎陷点株系和弱毒株系。根据CTV基因组序列特点,可将其分为T36,VT,T3和T30基因型,其中T30为弱毒株系,其它为强毒株系。为明确我国发生的CTV基因型特点及其混合发生状况,本研究对来自我国部分地区的CTV进行了分析,结果如下。1.比较分析了以总RNA为模板的常规RT-PCR、免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)和试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)3种方法进行CTV检测及株系区分的效果,结果显示,3种方法检测CTV均具较好的检测效果,但采用总RNA为模板时在进行常规检测及株系鉴定时,扩增产物的电泳条带均相对更清晰些;其它两种方法的扩增产物电泳条带虽相对较弱,不适合于用Bi-RT-PCR方法进行CTV株系的鉴定,但可用于大量样品的CTV检测。2.采用Bi-RT-PCR技术,对来自不同地区的141份柑橘样品进行了CTV强毒和弱毒株系的鉴定。结果显示,有107份柑橘样品的CTV检测结果为阳性,带毒率为75.8%,且所检测到的CTV均为强毒株系。3.选取10份柑橘样品,对其CP进行了扩增及扩增产物的HinfⅠ/RFLP分析,根据Gillings(1993)限道的分类规则,初步确定来自样品S45的CTV(CTV-S45)为HinfⅠ/RFLP类群V,LR1、S36、S37、S38和S39存在类群Ⅲ和Ⅴ的CTV混合感染,而样品S46为我国新鉴定出的类群Ⅷ与类群Ⅴ的混合侵染。4.选取以上8个CTV感染的柑橘样品及本研究室前期鉴定获得的2个CTV单一分离物感染的柑橘样品,采用10对基因型鉴定引物对其进行基因型分析,结果显示,除N21为VT基因型、N4为T30基因型CTV单一感染外,5个样品B15、B16、S36、S39和LRl存在基因型为VT、T36和T3的CTV混合感染;BX与S40存在4种基因型VT、T36、T3和T30的CTV混合感染;CTV-S45可能带有T3和T30基因型。这些结果表明,CTV强致病性株系VT和T3型在我国发生普遍。5.对采用引物VT-K17扩增产物进行了克隆及序列分析,结果显示,所测定分离物可较为明显地分为VT基因型与T30基因型两大类群。其中来自样品S45的2个分离物CTV-S45-2和CTV-S45-4与弱毒株系T30和T385亲缘关系较近,其扩增片段的核苷酸和氨基酸同源性分别在96.6%和94.9%。其它分离物与VT基因型聚为一类,而在该基因型类群中存在较大的分子变异,这些分离物可进一步分为3个组群,不同组群间存在特异性的核苷酸和氨基酸位点差异。6.对CTV-S45的CP、K17和Pol基因及5’UTR作进一步测序和序列分析,发现其CP基因编码氨基酸序列与T30同源性较高为97.3%,但在强毒和弱毒株系的标志性氨基酸位点(第63、122和124个氨基酸位点),CTV-S45与强毒株系相一致,分别为T、V、F。而在K17和Pol基因及5’UTR区域,则表现强毒和弱毒株系混合侵染的特点,推测可能存在不同株系间的基因重组或为一较特殊的分离物。
    
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