利用原生质体融合及基因工程的方法对柑橘采后生防菌34-9遗传改良的初步研究

Preliminary Studies on Genetic Improvement of Biocontrol Yeast 34-9 of Citrus by Protoplast Fusion and Genetic Engineering

作者: 专业:园艺学 导师:邓伯勋 年度:2010 学位:硕士  院校: 北方工业大学

Keywords

        生防酵母菌34-9(Kloeckera apiculata)是本实验室从自然界中自主分离得到的,对柑橘青、绿霉病具有很强的拮抗作用,但因絮凝性差、生物量低、抗菌谱窄和抑菌活性有待提高等问题,限制了其商业化应用。为了提高现有生防酵母的综合性状,迫切需要对其在基因水平上进行遗传改良,同时为进一步开发出新型、安全无毒、多功能的生物保鲜剂提供理论依据。本研究对菌株34-9的遗传改良进行了初步探索。采用双亲灭活原生质体融合技术,分析了影响亲本菌株34-9和酿酒酵母原生质体制备与再生的主要因素,明确了原生质体制备和再生的最佳条件,确立了原生质体灭活条件,对融合子进行了初步筛选和鉴定。同时利用根癌农杆菌介导的转化、醋酸锂法和电转化的转化方法,对菌株34-9转化条件进行了摸索,并对转化子进行了初步鉴定。主要研究结果如下:1.利用rDNA-ITS分子鉴定,进一步证实了菌株34-9的属、种名。确定该菌株为柠檬形克勒克氏酵母(K. apiculata),是有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora uvarum)的无性世代。2.分别确定了菌株34-9和酿酒酵母原生质体制备和再生的适宜条件。菌株34-9原生质体制备和再生的适宜条件:采用0.05 mol/L EDTA-Na2和0.5%p-巯基乙醇混合液,28℃预处理10min;培养时间为16h;酶解液浓为1.5%的蜗牛酶,酶解时间为3h;渗透压稳定剂为0.8 mol/L的KCl溶液。酿酒酵母原生质体制备和再生的适宜条件:最适产孢培养基为Kleyn;培养时间为26 h;酶解液浓度为1.5%的蜗牛酶,酶解时间为2h;渗透压稳定剂为0.8 mol/L的蔗糖溶液。3.确立了菌株34-9和酿酒酵母原生质体灭活的适宜条件。菌株34-9化学灭活的参数:0.9%的碘乙酸作用10 min;酿酒酵母热灭活参数:55℃作用15min。在28℃条件下,利用35%PEG-4000作为促融剂进行融合。4.以菌株34-9和酿酒酵母为亲本,进行原生质体双亲灭活和融合,经过菌落大小、絮凝性检测和对峙实验初步筛选出融合子RH-1,其絮凝形成速度比对照明显快且絮凝物大;并且融合子RH-1仍具有较好的抑菌效果。5.初步确定了菌株34-9电击转化的条件:对数生长期细胞,1 mol/L山梨醇处理,20μg/mL质粒DNA,电压1.5kv,电击时间5 msec,电阻200Ω,电容25μF,电击杯0.2 cm;经初步鉴定获得5株转化子,且具有很高的遗传稳定性。
    
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