拟南芥原生质体诱导愈伤组织的研究

Callus Induction of Arabidopsis Protoplasts

作者: 专业:发育生物学 导师:李兴国 年度:2010 学位:硕士  院校: 山东农业大学

Keywords

Arabidopsis, Protoplasts, Callus

        随着农业生物技术的发展,植物原生质体培养技术愈来愈受到重视,它为细胞工程和基因工程开辟了广阔的前景。植物原生质体是除去细胞壁外,仅为原生质膜所包裹的裸露细胞。由于失去了细胞壁的保护,所以原生质体十分脆弱,因此拟南芥原生质体诱导产生愈伤组织受到多种因素的影响,但是目前的工作缺乏系统而准确的研究。本文使用拟南芥叶片原生质体为材料,进行了原生质体诱导愈伤组织的研究,在不断地重复实验中,将拟南芥原生质体诱导愈伤组织的体系不断优化,并最终确定原生质体诱导愈伤组织培养过程中的各种实验条件。结果如下:1.酶解对原生质体的影响酶解液的浓度和酶解时间对原生质体的数量、活力和完整性有很大的影响。我们设计了酶液的9种组合,在相同的酶解时间里,对拟南芥叶片原生质体的提取情况进行了分析。此后,我们确定了酶液的浓度后,在相同酶液浓度下不同酶解时间的拟南芥叶片原生质体提取情况进行了分析。通过在荧光显微镜下的观察,以及FDA染色分析得出结论:在纤维素酶浓度为1.5%,果胶酶浓度为1.0%,酶解时间为12h时能得到数量多而且活力旺盛的原生质体。2.影响原生质体提取的因素提取原生质体的过程中,拟南芥原生质体的质量受拟南芥取材时期、取材部位、离心等的影响。我们将拟南芥的叶片分为已经抽薹的拟南芥的叶片和未抽薹的拟南芥叶片,已经抽薹的拟南芥叶片又分为莲座叶和茎生叶。已经抽薹的拟南芥的叶片提取的原生质体数量少,活性低,容易破裂,而未抽薹的拟南芥叶片原生质体提取的原生质体数量多,活性高,有一定的韧性,不易破裂。已经抽薹的拟南芥的莲座叶和茎生叶的原生质体提取后在数量和活性上无太大区别。离心转速采用50g,离心方法用梯度离心的效果最好。3.影响原生质体培养的因素提取原生质体的不同生态型、包埋原生质体以及培养原生质体的方法对拟南芥原生质体诱导愈伤组织有很大的影响。Ws生态型较Col生态型的原生质体更容易诱导产生愈伤组织,同时我们使用了以根为外植体诱导产生的愈伤组织的原生质体,诱导产生愈伤组织的频率是最高的。利用海藻酸钠和氯化钙包埋方法进行拟南芥包埋培养,拟南芥分裂一次后就停止分裂,而且褐化严重;改进之后,添加液体培养基,进行固液双层培养,容易造成污染,改善效果不明显。利用低熔点琼脂糖培养方法可以同时解决包埋和培养的问题,而且不容易受污染,是最理想的培养方法。
    Plant protoplasts culture plays an important role in biology technology. Plant protoplast is the exposed cell wrapped by plasma membrane whose cell wall is removed. Because of losing of protection from the cell wall, protoplasts are weak. Callus induction from Arabidopsis protoplasts is effected by many factors, but this work has not been systematically and accurately studied. In this study, we induced callus from the Arabidopsis protoplasts and confirm the conditions of the callus induction from Arabidopsis protoplasts. The results are as follows:1. The effect to the Arabidopsis protoplasts from enzymatic hydrolysisThe activity, integrity and number of the protoplasts are affected by the enzyme concentration and hydrolysis time. Nine combinations of the cellulase and pectinase were designed to confirm the best enzyme concentration. Protoplasts were isolated after different times in the same enzyme concentration. FDA staining showed that 12h enzymatic hydrolysis in enzyme solution containing 1.5% cellulose and 1.0% pectinase gets high quality protoplasts.2. Factors affecting Arabidopsis protoplasts isolationThe process of protoplasts isolation is affected by developmental stage, sampling parts of Arabidopsis and centrifugation. Rosette leaves and cauline leaves were used for protoplasts isolation. Our results show that the quality of protoplasts isolated from bolting Arabidopsis leaves is better than from non-bolting Arabidopsis leaves. The quality of protoplasts has no significant difference between protoplasts isolated from rosette leaves and cauline leaves. We isolated protoplasts by gradient centrifugation at the rate of 50g.3. Factors affecting Arabidopsis protoplasts cultureCallus induction of Arabidopsis protoplasts is affected by different ecotypes and the methods of protoplasts embedding and culture. The callus induction is easier in Ws than in ecotype Col. The frequency of callus induction from protoplasts isolated from the callus induced by root is the highest. Protoplasts are seriously brown and died after one split in alginate film culture. Liquid-solid-double-layer culture is easily polluted in alginate film culture. Low melting point agarose plating culture is the best method.
        

拟南芥原生质体诱导愈伤组织的研究

摘要8-10
Abstract10-11
1 引言12-33
    1.1 植物器官离体再生的种类12-14
        1.1.1 花芽的离体再生12-13
        1.1.2 根和芽的离体再生13
        1.1.3 花器官的离体再生13-14
        1.1.4 果实的离体再生14
    1.2 外植体对离体器官再生的影响14-16
        1.2.1 外植体大小对离体器官再生的影响14-15
        1.2.2 外植体极性对离体器官再生的影响15
        1.2.3 外植体分化时期对离体器官再生的影响15-16
        1.2.4 外植体遗传背景对离体器官再生的影响16
    1.3 植物体细胞胚胎发生及研究进展16-21
        1.3.1 植物体细胞胚胎发生的意义16-18
        1.3.2 植物体细胞胚胎发生的研究基础18-19
        1.3.3 拟南芥中已经建立的体细胞胚胎发生系统19-21
            1.3.3.1 压力诱导体细胞胚胎发生系统19-20
            1.3.3.2 以未成熟合子胚做外植体诱导体细胞胚胎发生20-21
    1.4 植物体细胞胚胎发生的细胞生物学研究21-22
        1.4.1 体细胞胚胎发生的起源21-22
        1.4.2 体细胞胚胎极性的建立22
    1.5 激素调控植物生长发育22-27
        1.5.1 生长素对植物生长发育的作用23-24
        1.5.2 细胞分裂素对植物生长发育的作用24
        1.5.3 生长素与细胞分裂素的互作24-25
        1.5.4 激素分布对器官再生的影响25-26
        1.5.5 激素信号转导决定细胞命运26
        1.5.6 激素调控器官特征基因表达26-27
    1.6 原生质体技术的发展27-28
        1.6.1 细胞融合技术发展的历史回顾27
        1.6.2 植物原生质体技术的发展27-28
        1.6.3 PEG 作为促融剂引起的革命28
    1.7 原生质体技术的应用28-32
        1.7.1 原生质体培养技术在果蔬生产上的应用29-30
            1.7.1.1 果树原生质体的应用29
            1.7.1.2 草莓原生质体的应用29
            1.7.1.3 花椰菜原生质体的应用29-30
            1.7.1.4 甜瓜原生质体的应用30
        1.7.2 原生质体培养技术在粮食作物生产上的应用30
        1.7.3 原生质体培养技术在其他植物培养上的应用30-31
            1.7.3.1 原生质体技术在牧草培养上的应用30-31
            1.7.3.2 原生质体在观赏作物上的应用31
            1.7.3.3 原生质体技术在药用植物上的应用31
            1.7.3.4 原生质体技术在麻类植物上的应用31
        1.7.4 原生质体技术在拟南芥上的研究进展31-32
    1.8 本课题研究的目的意义32-33
2 材料与方法33-37
    2.1 实验材料与试剂33
    2.2 实验方法33-37
        2.2.1 拟南芥幼苗培养33
        2.2.2 拟南芥植株种植33-34
        2.2.3 外植体的获得与培养34
        2.2.4 培养基34-35
        2.2.5 酶液浓度设计35-36
        2.2.6 FDA 染色分析36
        2.2.7 DAPI 染色36
        2.2.8 原生质体的观察及记录36
        2.2.9 结果统计36-37
3 结果37-51
    3.1 原生质体提取的影响因素37-41
        3.1.1 酶解液浓度和酶解时间的影响37-39
        3.1.2 取材的影响39-41
    3.2 愈伤组织形成的影响因素41-44
        3.2.1 取材的影响41-42
        3.2.2 酶解液的影响42-44
            3.2.2.1 酶解液浓度的影响42-43
            3.2.2.2 酶解时间的影响43-44
    3.3 离心的影响44-45
        3.3.1 离心速度的影响44
        3.3.2 离心方法的影响44-45
    3.4 包埋和培养方法的影响45-51
        3.4.1 液体浅层培养45
        3.4.2 包埋的影响45-47
        3.4.3 培养方法的影响47-51
            3.4.3.1 琼脂糖岛培养47
            3.4.3.2 液体-固体双层培养47
            3.4.3.3 琼脂糖固体平板培养47-51
4 讨论51-54
    4.1 原生质体提取方法影响愈伤组织的诱导51-52
    4.2 材料的遗传背景影响愈伤组织的诱导52
    4.3 培养方法影响愈伤组织的诱导52-53
    4.4 激素影响愈伤组织的诱导53-54
5 结论54-55
参考文献55-65
附录65-70
致谢70
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